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中华人民共和国国家标准 中华人民共和国国家标准

食品中杂色曲霉素的测定方法 GB 5009.25-85

Method for determination of sterigmatocystin in foods
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本标准适用于大辍⒂衩住⑿÷蟆⒒贫辜盎ㄉ等各种食品中杂色曲霉素的测定。
1　原理
　　样品中的杂色曲霉素经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加
热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质，根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来
测定样品中杂色曲霉素的含量。
2　试剂　　　　　　　　
2.1 同GB 5009.22-85《食品中黄曲霉毒素B1的测定方法》2.1～2.4。
2.2　冰乙酸。
2.3　甲酸。
2.4 95%乙酸。
2.5　4％氯化钠溶液。
2.6 20％三氯化铝-乙醇溶液:称取20g三氯化铝(AlCl3・6H2O)溶于100ml乙醇中,过滤,室
温看妗
2.7 杂色曲霉素标准溶液:用杂色曲霉素标准品配制成每毫升相当于10μg的苯溶液。用
紫外分光光度计标定其浓度(最大吸收峰的波长325nm，分子量324, 摩尔消光系数15200),
并作硅胶薄层色谱纯度鉴定，避光，放置于4℃冰箱中保存。
2.8　杂色曲霉素标准使用液：勘浇10μg/ml的杂色曲霉素标准溶液稀释成每毫升相当
于1和0.4μg的杂色曲霉素溶液。避光, 放置于4℃冰箱中保存。
3　仪器
3.1 同GB 5009.22-85第3章。
3.2 玻璃板：10×10cm与10×18.5cm两种。
3.3 展开槽: 内长10cm、宽4.5cm、高17cm与内长11.5cm、宽60cm、19cm。
3.4　玻璃喷雾器。
3.5 空气泵或油泵。
4　操作方法　　　　
4.1　提取
4.1.1 大米、玉米、小麦、黄豆及花生：称取20g过20目筛的大米、玉米、小麦及黄豆
样品(花生样品过10目筛孔)，置于具塞锥形瓶中，加80ml体积比为90:10的甲醇-4％氯
化钠水溶液，振荡30min, 过滤。收集样液40ml(黄豆、花生样品则取20ml，加入20ml提
取剂)，移入250ml分液漏斗中，再加入25ml4％氯化钠溶液(使甲醇与水之体积比为55:45)
和25ml石油醚，振摇2min, 静置分层。上层石油醚溶液置锥形瓶中, 下层溶液仍移入原
分液漏斗中, 再用25ml苡兔烟崛∫淮巍Ｗ詈蠼两次上层的石油醚溶液合并，加入25ml
体积比为55：45的甲醇-4％氯化钠溶液，振摇30s(黄豆、花生样品则加入25ml体积比为
70：30甲醇-4％氯化钠溶液，振摇30s)，将下层并于原甲醇水层中，重复用55:45甲醇-
4％氯化钠溶液提取两次(黄豆、花生样品芨从70:30的甲醇-4％氯化钠溶液提取一次)，
以提取该层的杂色曲霉素。下层溶液合并后加30ml三氯甲烷(黄豆、花生样品除加三氯甲
烷外，再加13ml4％氯化钠溶液，使甲醇与水的体积比为55:45)，振摇2min，静置。待上
层混浊液有部分澄清时，即可将下层溶液经放有约10g无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于
蒸发皿中。于分液漏斗中再加10ml三氯甲烷，重复提取一次,将该下层溶液和用少量三氯
甲烷洗滤器的洗液一并放入蒸发皿中。将蒸发皿放置于65℃水浴上挥干，然后再在冰浴
上放置2～3min，加1.0ml苯将残留物充分混匀，置入小试管中。或将以上蒸发皿中残留
物用三氯甲烷移于浓缩管中，于65℃用减压吹气法浓缩至干，加入1.0ml苯，供色谱测
定，此1ml大米、玉米及小麦样液各相当于10g样品，1ml黄豆与花生样液则各相当于5g
样品。
4.2　测定
4.2.1　薄层板的制备：制备方法同GB 5009.22-85中4.3.1.1，园阌5g硅胶G可制成
10×10cm，厚度0.3mm的薄层板五块。
4.2.2 点样：取两块10×10cm薄层板，在距板下端各0.8～1cm基线上滴加标准使用液
与样液如下: 距左边缘0.8～1cm处各滴加10μl 0.4μg/ml标准使用液，在距左边缘4cm
处各滴加80μl样液(黄豆、花生样品为40μl)，然后在第二块板的样液点加滴10μl 0.4
μg/ml标准使用液，在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。
4.2.3 展开
4.2.3.1 横向展开：展开剂是乙醚－正己烷―苯-三氯甲烷―甲酸(3:9:1.5:1.5:0.6) 
15.6ml(由于此混合液不成一相，每一展开槽的用量须单独配制)l用前充分摇匀，一并
倒入槽内使用。将靠近标准点的一边，放入槽内展至9cm左右取出挥干。
4.2.3.2 纵向展开：展开剂为苯-甲醇―冰乙酸(90:8:2或92.5:6:1.5)15ml。将靠
近标准点与样液点的一边放入槽内，展开9cm左右取出挥干。
4.2.4　显荧光：在薄层板上喷20％三l化铝―乙醇溶液，置80℃，加热10min，立即
在紫外光灯(波长365nm)下观察结果，待薄层板冷却后再薄薄的喷第二次(不需加热)，
可直接观察结果。
4.2.5 观察与评定结果：在紫外光灯下观察，若第二板的第二点在标准点的相应处出
现最低检出量，而在第一板的相同位置l未出现荧光点，则样品中杂色曲霉素含量在
5μg/kg以下(黄豆、花生样品为20μg/kg以下);若出现荧光点的强度与标准点的最低
检出量的荧光强度相等，而且此荧光点又同第二板样液的标准点相重叠，则样品中杂
色曲霉素含量为5μg/kg(黄豆、花生样品为20μg/kg); 若出现荧光强度比标准点的最
低检出量强，则根据其荧光强度估计减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微
升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。在喷三氯化铝第一、
二次后分别进行观察评定，两次结果应一致。若结果为阳性，则将薄层板放暗处10min,
再观察一次,如样品仍为阳性,进一步作确证试验即在距薄层板(10×18.5cm)下端3cm的
基线上滴加一个点的10μl0.4μg/ml标准使用液与3个点的样液，每点16μl。在样液
的一个点上再加滴10μl0.4μg/ml标准使用液，另一点上再加滴10μl1μg/ml标准使
用液。于各点上n加一小滴三氟乙酸，放暗处反应10min，热风吹5min，使薄层板上的
温度不高于40℃，用冰乙酸-苯(10：90)展开1～2次,直至杂色曲霉素衍生物与杂质分开
为止。展开时要避光，以下显荧光步骤同4.2.4。最后将板在紫外光灯下观察，如样液
为阳性，应产生与杂色曲霉素标准重n的衍生物。确证法的灵敏度：大米、玉米、小
麦为25μg/kg(黄豆、花生样品为50μg/kg)。
4.2.6　计算
V1 × D 1000
X = 0.004 ×───── × ────
V2 m
式中：X──杂色曲霉素含量，μg/kg；
　　V1──样液浓缩后体积，ml;
V2──出现最低荧光样液的滴加体积, ml;
D──浓缩样液的总稀释倍数;
m──浓缩样液中所相当的样品质量,g;
0.004──杂色曲霉素的最低检出量,μg。

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附加说明:
本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出, 由卫生部食品卫生监
督检验所归口。
　　本标准由中国预防医学中心卫生研究所负责起草。